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Mar 28, 2023

Espectroscopia de desactivación electromagnética del coronavirus humano 229E

Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8886 (2023) Citar este artículo

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Detalles de métricas

Se logra una investigación de la desactivación de patógenos usando ondas electromagnéticas en la región de microondas del espectro utilizando estructuras de guía de ondas hechas a la medida. Las guías de onda cuentan con rejillas de sublongitud de onda para permitir la integración de un sistema de refrigeración por aire sin perturbar los campos de propagación internos. Las guías de ondas están ahusadas para acomodar internamente una muestra experimental con suficiente flujo de aire circundante. La metodología propuesta permite un control preciso sobre las densidades de potencia debido al modo fundamental bien definido excitado en cada guía de onda, además del control de la temperatura de la muestra debido a la exposición a microondas a lo largo del tiempo. El coronavirus humano (HCoV-229E) se investiga en el rango de 0 a 40 GHz, donde se observa una reducción viral máxima de 3 log en la subbanda de 15,0 a 19,5 GHz. Concluimos que HCoV-229E tiene una resonancia intrínseca en este rango, donde el daño estructural no térmico es óptimo a través del efecto de transferencia de energía resonante de la estructura.

La desactivación de patógenos mediante ondas electromagnéticas (EM) en la banda de microondas está atrayendo un creciente interés de investigación1,2,3,4,5,6,7,8,9. La naturaleza sin contacto de la desactivación de microondas es una característica que hace que el método sea particularmente útil en el contexto de las crisis de salud pública causadas por la reciente y actual pandemia de SARS-CoV-2. Las microondas pueden desactivar un virión de una de dos maneras: mediante calentamiento térmico o mediante un proceso conocido como transferencia de energía resonante estructural (SRET). Este último se basa en la idea de que los virus envueltos con geometrías esféricas simples resonarán en presencia de una onda EM2,3,4,5. Es importante maximizar la amplitud de las vibraciones acústicas excitadas dentro de un virus esférico para causar el mayor desplazamiento y tensión en la estructura de la envoltura, lo que eventualmente puede causar su ruptura. Los modelos actuales de vibraciones acústicas de modo dipolar en virus esféricos predicen que la mayor tensión aplicada por ondas EM de igual intensidad se produce en el régimen de microondas2,4,10, lo que está respaldado por un creciente cuerpo de evidencia experimental2,3,5. La desactivación del virus de la Influenza A (H3N2) ha sido demostrada utilizando microondas de baja densidad de potencia, en las que la membrana del virus se rompe a través del efecto SRET2. En ese estudio, una solución viral vio una reducción de 3 log del virus activo después de 15 minutos de iluminación de microondas desde una antena de bocina que operaba a 8,2 GHz. La aplicación del efecto SRET es un medio no térmico prometedor para desactivar patógenos dañinos con resonancias intrínsecas en el régimen de microondas debido a las bajas densidades de potencia sugeridas requeridas2,3,4.

La esterilización por microondas sin calentamiento de baja potencia requiere el conocimiento de la resonancia natural intrínseca del virión para transferir de manera más eficiente la mayor parte de la energía limitada disponible. El estudio experimental de la espectroscopia de absorción de microondas de un virus es un desafío técnico, principalmente debido a la sensibilidad requerida para detectar y distinguir razonablemente una respuesta atribuida a las partículas de tamaño pequeño. Los métodos propuestos involucran líneas de transmisión de microondas en las que se introducen pequeños volúmenes de solución para perturbar las microondas guiadas dentro de la estructura2,3,5,8. Primero se mide el sensor con solo el fluido portador como referencia, y luego se realiza una medición que contiene alguna concentración de virus. Luego se realiza una comparación relativa para identificar los regímenes en los que se pierde más potencia de microondas, lo que indica la absorción por parte del virus. Esta metodología se ha utilizado para identificar resonancias de absorción de microondas de SARS-CoV-23, influenza A (H3N2)2 y virus del síndrome de la mancha blanca8.

En este informe, presentamos una nueva metodología de temperatura controlada para estudiar las interacciones electromagnéticas con patógenos. El coronavirus humano HCoV-229E (229E) se selecciona para ser utilizado como modelo de bioseguridad sustituto para coronavirus más altamente patógenos. Su geometría esférica y la disposición de las proteínas en espiga son representativas de muchos virus envueltos. Nuestra metodología se demuestra mediante el estudio de la desactivación basada en SRET de 229E que cubre 0,8–40 GHz e identificando una resonancia intrínseca dentro del régimen de 15,0–19,5 GHz. Dentro de este régimen, se observó una reducción logarítmica de 3 del virus activo después de solo 7,5 minutos de exposición al microondas. Se utilizan guías de ondas rectangulares que están diseñadas para acomodar una muestra internamente, exponiendo la muestra a campos eléctricos bien definidos. Esto posee la ventaja clave de tener un control preciso sobre la intensidad del campo y la densidad de potencia expuesta a la muestra experimental. Las rejillas de sublongitud de onda se introducen en las paredes de la guía de ondas para integrar un sistema de enfriamiento de flujo de aire sin perturbar los campos de propagación. Durante los experimentos, las muestras virales se enfrían continuamente para garantizar que cualquier desactivación observada se atribuya a las vibraciones acústicas inducidas por SRET, en lugar de un exceso de calentamiento por microondas de la solución portadora. Usando esta metodología, los virus se pueden estudiar bajo diferentes densidades de potencia y criterios de tiempo, de modo que se puedan determinar los regímenes de frecuencia óptimos y el grado esperado de desactivación del virus. Esta información es fundamental para el desarrollo de nuevas tecnologías basadas en microondas para el control de la transmisión, la esterilización y los tratamientos clínicos.

Para irradiar uniformemente las muestras virales mientras se controla la temperatura, se diseñó una serie de guías de ondas para dirigir la potencia de radiofrecuencia (RF) hacia la muestra y también permitir que el aire fluya más allá de la muestra para mantener la temperatura. Estas guías de ondas fueron diseñadas para irradiar muestras a través de un ancho de banda tan amplio como sea posible mientras operan en el modo fundamental, utilizando lanzadores de guías de ondas comerciales cuando sea posible. Esto dictó el uso de muchas bandas de guía de ondas para cubrir una gran franja de espectro, como se muestra en la Tabla 1. La Tabla 1 muestra las dimensiones de la guía de ondas de alimentación (a y b), así como las dimensiones de la guía de ondas donde se ubicaba el tubo ( \(a_{tubo}\) y \(b_{tubo}\)). En la Fig. 1 se muestra un ejemplo de estas dimensiones. Esta imagen se generó a partir del modelo CAD (diseño asistido por computadora) utilizado para diseñar las guías de ondas. Todo el trabajo de CAD mecánico se completó en Dassault Systems Solidworks 2021.

En todos los casos se utilizaron lanzadores coaxiales a guía de ondas, excepto en la banda inferior (0,8-1,8 GHz) para la alimentación de una sonda de guía de ondas de placa de circuito impreso (PCB) en una guía de ondas de altura reducida. Todos los tubos de ensayo se llenaron con \(600~\mu l\) de fluido y se ubicaron en el centro de la guía de ondas, con el fluido posicionado en el centro de la sección transversal de la guía de ondas para maximizar la exposición de la muestra al campo electromagnetico. A frecuencias más altas, esto requería expandir \(a_{tube}\) y \(b_{tube}\) en relación con a y b para que la muestra viral encajara completamente en la guía de ondas y dejar espacio entre el tubo de ensayo y las paredes del tubo. guía de ondas para refrigeración.

(a) Vista superior y (b) lateral de un sensor de guía de ondas que muestra las dimensiones de la alimentación (a y b) y las dimensiones de la guía de ondas alrededor del tubo de ensayo. Imagen generada a partir del modelo CAD de las guías de onda diseñadas en Dassault Systemes Solidworks (Versión 2021).

Las muestras del tubo de ensayo se enfrían forzando el aire a través de la guía de ondas y pasando el tubo de muestra. Esto se logró usando ventiladores, como se muestra en la Fig. 2, que forzaron el aire a través de rejillas en el costado de la guía de ondas, pasando la muestra y saliendo a través de un conducto de escape. Estas rejillas fueron metalizadas y diseñadas para tener orificios lo suficientemente grandes como para dejar pasar el aire, pero lo suficientemente pequeños en relación con la longitud de onda de la señal para contener la mayor parte de la energía de RF dentro de la guía de ondas.

Montaje general de sensor de guía de ondas. Imagen generada a partir del modelo CAD de las guías de onda diseñadas en Dassault Systemes Solidworks (Versión 2021). Los modelos para los lanzadores WR90 se proporcionaron de forma gratuita a partir del 11.

Las guías de ondas se imprimieron en 3D mediante modelado por deposición fundida (FDM) a partir de ácido poliláctico (PLA) y se metalizaron con cinta de aluminio. Esta técnica es conveniente para la creación rápida de prototipos de piezas de guía de ondas con un rendimiento similar al de los componentes totalmente metálicos 12,13. Este método se usó para ensamblar cada una de las bandas de guía de ondas que se muestran en la Tabla 1, excepto la banda más baja. Por debajo de 1,8 GHz, la guía de ondas se implementó doblando láminas de metal para formar las paredes y se imprimió en 3D un marco de andamiaje para mantener unidas las láminas de metal. Como se señaló anteriormente, esta guía de ondas se alimentó con una sonda de PCB. Las imágenes de muestra de las guías de ondas ensambladas se muestran en la Fig. 3. Las estructuras de las guías de ondas se simularon utilizando un solucionador de elementos finitos de onda completa (ANSYS HFSS) para determinar las intensidades de campo en el centro del tubo de muestra viral. La potencia de entrada se fijó en 2 Watts y se realizaron simulaciones para el caso de un tubo vacío lleno de aire y el caso de un tubo lleno con el modelo dieléctrico para la solución portadora viral. Las intensidades de campo simuladas se muestran en la Fig. 4. Las intensidades de campo para el tubo de ensayo lleno de líquido en comparación con el tubo de ensayo lleno de aire (especialmente a frecuencias más altas) se deben al aumento de \(\epsilon _r\) de la solución portadora. con la frecuencia en comparación con el aire.

Imágenes de componentes de guía de ondas ensamblados y amplificador de potencia utilizados para completar los experimentos de desactivación viral, cada una de las guías de ondas fue diseñada e impresa por el grupo, y el amplificador fue ensamblado por el grupo utilizando componentes estándar.

Intensidades de campo simuladas en el centro del tubo de ensayo cuando el tubo de ensayo se llenó con (a) aire o (b) medio de suero reducido.

La permitividad compleja proporciona una descripción EM armónica de tiempo completo de un medio. La permitividad compleja del medio de suero reducido (OptiMEM) sin ningún virus se caracteriza utilizando el método de sonda coaxial abierta. Se genera un modelo dependiente de la frecuencia usando una metodología14 previamente desarrollada y se muestra en la Fig. 5 junto con agua desionizada (DI) como referencia. La alta constante dieléctrica del medio de suero reducido puede causar reflexiones significativas dentro de la guía de ondas llena de aire y, si no se tiene en cuenta en el diseño, la coincidencia de entrada de las guías de ondas experimentales podría degradarse gravemente. Por esta razón, el modelo de permitividad está integrado dentro de las herramientas de simulación EM para ayudar a diseñar, ajustar y evaluar estructuras de guía de ondas de modo que se logre un alto rendimiento de RF en los casos experimentales que contienen muestras. Dado que la concentración viral en las muestras es baja, se supuso que habría un impacto mínimo en las propiedades dieléctricas de los medios de suero reducido, independientemente de la presencia del virus.

Modelo dieléctrico de medio de suero reducido en comparación con agua desionizada (DI).

La potencia de microondas absorbida por muestras experimentales provoca tanto calentamiento como alteraciones en la estructura del virus. Sin un sistema de enfriamiento para eliminar el exceso de calor, la temperatura del virus podría alcanzar los criterios suficientes para que se observara una reducción relacionada con el calor. El calentamiento del medio de suero reducido debido a la exposición a microondas durante los procedimientos experimentales se caracteriza para verificar que el sistema de enfriamiento integrado pueda eliminar suficientemente el exceso de calor y garantizar que cualquier desactivación viral observada no se atribuya al calor. Específicamente, en todos los experimentos, la temperatura del virus no debe exceder los 44 \(^\circ\)C, ya que se esperaría cierto grado de desactivación del HCoV-229E relacionada con el calor. Se sabe que otros coronavirus muestran inactivación cuando se calientan en el rango de \(44^\circ C-65^\circ C\) en escalas de tiempo cortas comparables (< 15 min) a las utilizadas en este trabajo15. Se observa alguna variación del calentamiento de la muestra experimental en el espectro investigado en este estudio. Aunque la potencia de entrada es constante para todos los casos experimentales, la variación de las dimensiones de la guía de ondas varía la densidad de potencia de las ondas guiadas, así como también altera el espacio que rodea la muestra para que fluya el aire. Además, las propiedades dieléctricas del medio de suero reducido varían con la frecuencia, es decir, la tangente de pérdida, que influye en la fracción de energía absorbida por el medio. Por estas razones, la caracterización del calentamiento de la muestra se debe realizar en todos los casos individualmente para verificar que la muestra se haya enfriado lo suficiente. El aumento de temperatura con respecto a la temperatura ambiente nominal (25 \(^\circ\)C) durante los experimentos de desactivación se resume en la Tabla 2. En todos los casos, el calentamiento de la muestra acumulada permanece por debajo de los 15 \(^\circ\)C, lo que garantiza ninguna muestra experimental superaría los 40 \(^\circ\)C en todos los casos.

La desactivación de HCoV-229E se estudia en subdivisiones de todo el espectro de frecuencias hasta 40 GHz. Se preparan múltiples muestras que contienen la misma concentración de HCoV-229E para cada subbanda, de modo que los experimentos se pueden repetir varias veces para mejorar la confianza en los resultados. Las muestras se dividen en grupos experimentales y de control, donde solo las muestras experimentales se insertan en la estructura de la guía de ondas y se exponen a un rango de frecuencias. Los detalles del plan de barrido experimental para cada subbanda se proporcionan en la sección de metodología. El análisis de ensayo de placas se usa para determinar la concentración viral activa después de la exposición a microondas, que se compara con la muestra de control para establecer la reducción viral relativa. Para todas las bandas, la reducción viral promedio en todos los ensayos se muestra en la Fig. 6, cada una con una barra de error que representa la desviación estándar del conjunto experimental. Estos resultados se resumen en la Tabla 2. Si la reducción promedio es menos de diez veces en comparación con el control, o si los conjuntos experimentales y de control tienen intervalos de desviación estándar superpuestos, se informa "insignificante" en la columna "Reducción viral" en la Tabla 2 para ese experimento Para todas las bandas, la reducción viral observada se muestra en la Fig. 6 y se resume en la Tabla 2. La reducción viral debe ser estadísticamente significativa y superior a diez veces; de lo contrario, se informa "insignificante" para la banda respectiva.

Inactivación de virus en respuesta a la exposición a microondas.

Los hallazgos principales de este estudio revelan una resonancia intrínseca de HCoV-229E ubicada dentro del régimen de frecuencia de 15,0 a 19,5 GHz. Después de 7,5 minutos de exposición a microondas, se observa una reducción de 3 log en la concentración de virus activo dentro de esta banda. Este nivel de desactivación viral es comparable al observado en otros estudios SRET, aunque se logra en un tiempo más corto. Además, se observó una reducción de 1 logaritmo en la banda adyacente de 12,4–15,0 GHz, lo que indica cierta sensibilidad, pero no tan óptima y eficiente cerca de la resonancia. Fuera del rango de 12,4 a 19,5 GHz, no se observó una reducción sustancial y estadísticamente significativa. El mayor calentamiento de la muestra se produjo en el rango de 8,2 a 12,4 GHz, alcanzando los 40 \(^\circ\)C durante los experimentos, aunque no se observó una reducción significativa. Este resultado respalda aún más que la reducción viral observada en otras bandas se atribuye al daño estructural debido al efecto SRET en lugar del calentamiento.

A los efectos de la espectroscopia de desactivación viral, las guías de ondas rectangulares son ventajosas en comparación con otras soluciones guiadas (líneas de microcinta, guía de ondas coplanar) y radiantes (antenas). En primer lugar, los campos dentro de las guías de ondas rectangulares tienen modos de propagación bien definidos. Esto hace que la determinación de los campos eléctricos y la densidad de potencia dentro de la guía de ondas, incluso en presencia de una muestra experimental, sea más precisa. Esto es particularmente útil en casos donde el interés es estudiar la respuesta de desactivación de un patógeno a varias intensidades de campo o densidades de potencia. Además, las guías de ondas rectangulares se pueden estrechar para proporcionar espacio adicional para la integración conveniente de una muestra experimental, como se hizo en este trabajo. Esto alterará la sección transversal de la guía donde se encuentra la muestra, pero no los modos de propagación, por lo que las densidades de potencia y las intensidades del campo eléctrico aún se pueden determinar con precisión. Las líneas de transmisión de la placa de circuito impreso, como las líneas microstrip o las guías de ondas coplanares, están más limitadas en términos de espacio disponible y facilidad para integrar una muestra experimental. En estos casos, las muestras experimentales solo pueden colocarse prácticamente sobre el conductor del lado de la señal. Sin embargo, hacerlo es extremadamente ineficiente en términos de exposición al campo de la muestra, ya que los campos están contenidos principalmente dentro del sustrato entre la señal del lado superior y los conductores de tierra del lado inverso. Los sistemas que irradian una muestra de virus mediante antenas comparten la misma facilidad de integración de muestras que las guías de ondas rectangulares; sin embargo, no son adecuados para configuraciones de alta potencia. Si bien el hardware de la antena puede manejar alta potencia, la radiación a estos niveles requiere materiales absorbentes adicionales y blindaje de RF para ejecutarse de manera segura, y está sujeto a regulaciones y restricciones adicionales16,17. Por el contrario, las guías de ondas rectangulares pueden manejar y autocontener altos niveles de potencia, lo que minimiza los riesgos de exposición a RF para el personal involucrado en la realización de los experimentos.

El desarrollo de sistemas de esterilización basados ​​en microondas, tratamientos clínicos y otras tecnologías de control de transmisión se basan fundamentalmente en el conocimiento de qué frecuencias utilizar y el grado de reducción viral activa que se espera durante un tiempo determinado. Se ha demostrado que la metodología de espectroscopia de desactivación viral descrita en este artículo produce esta información para HCoV-229E y también es aplicable para estudiar otras interacciones electromagnéticas con patógenos en el régimen de microondas. Además, la metodología propuesta se puede utilizar para estudiar los efectos de los niveles de potencia incidente, así como la duración de la exposición en relación con la reducción del virus SRET, que se sabe que tienen influencia2 En general, exponer una muestra de virus a microondas provoca cierto grado de calentamiento además a las vibraciones acústicas inducidas dentro de los viriones. Sin embargo, el control de temperatura integrado de las guías de ondas experimentales brinda confianza de que la reducción viral observada se atribuye al daño estructural de las vibraciones acústicas en lugar del exceso de calor. En términos de control de transmisión de patógenos, el calentamiento puede ser indeseable. En entornos de esterilización, muchos materiales pueden degradarse o dañarse si se calientan durante mucho tiempo oa temperaturas relativamente altas. Las tecnologías de microondas de baja potencia son prometedoras para estos entornos, ya que es posible una reducción significativa de virus activos mientras se mantienen niveles seguros de calentamiento.

En este informe se presenta una metodología novedosa para estudiar la inactivación funcional de virus en respuesta a campos electromagnéticos. La metodología propuesta se demostró estudiando 229E en el espectro de microondas e identificando regímenes con una reducción clara y significativa de la infectividad viral. Como se describe en nuestra sección "Discusión", esta información se puede utilizar para desarrollar y optimizar la tecnología de control de transmisión dirigida a virus esféricos similares. Se requerirían más estudios más allá del alcance de este trabajo para confirmar los mecanismos precisos del daño estructural del virus en respuesta a los campos electromagnéticos.

La guía de ondas enfriada por aire fue diseñada para imprimirse en 3D a partir de PLA y metalizarse con cinta de papel de aluminio. Esta metodología de diseño se ha probado previamente en 12,13,18 y permite la creación rápida de prototipos de componentes de guía de ondas. Cada guía de ondas se imprimió en cuatro secciones, lo que permitió que la cinta de aluminio se aplicara a una superficie plana para reducir las arrugas. Las secciones de la guía de ondas fueron ranuradas y atornilladas. Cada una de las guías de ondas se alimentó con lanzadores de guías de ondas estándar disponibles en el mercado y se afilaron para acomodar el tamaño del tubo de muestra viral. Para enfriar las muestras, se cortaron agujeros en los lados de la guía de ondas y se llenaron con una rejilla. Esta rejilla permitía que el aire pasara a través de la guía de ondas, pero contenía la potencia de RF dentro de la guía. Para cada guía de ondas, estos se imprimieron como una pieza separada y se metalizaron en el lado de la guía de ondas con cinta de aluminio y en el exterior con una pintura a base de cobre conductor (MG-Chemicals 843WB) para aumentar el aislamiento. Cada guía de ondas tenía cuatro de estas rejillas; dos tenían ventiladores axiales para forzar el aire hacia la guía de ondas y los otros dos actuaban como puertos de salida con conductos para dirigir el aire caliente lejos de la entrada del ventilador. Finalmente, cada guía de ondas incluía una ubicación para el tubo de muestra. Este era un agujero en el costado de la guía de ondas que se ajustaba perfectamente al tubo de ensayo y estaba metalizado y tenía una tapa de protección metalizada que en conjunto contenía la energía de RF en la guía de ondas.

Se utiliza un generador de señales (Anritsu MG3694A) para generar tonos de microondas en las frecuencias deseadas. Las etapas de amplificación de potencia se utilizan para aumentar la potencia de los tonos del generador de señal de modo que se suministren 2 W de potencia a la entrada de la guía de ondas experimental. Se requirieron múltiples configuraciones de aplicación de energía para cubrir el amplio espectro estudiado. En el rango de 0,8 a 8,2 GHz, se utilizan cinco amplificadores de paquete (Analog Devices HMC659LC5): uno en serie y cuatro en paralelo, que se combinan para alcanzar el nivel de potencia objetivo. En los rangos de 8,2 a 19,5 GHz y de 20 a 40 GHz, se utiliza un solo amplificador en paquete (minicircuitos ZVE-3W-183+ y Qorvo QPA2640D, respectivamente) para la amplificación de potencia. La respuesta de potencia de todas las etapas de amplificación se caracteriza por el barrido de la potencia incidente del generador de señal y la medición de la potencia de salida en un analizador de espectro (Anritsu E4446A). Este procedimiento se repite en cada frecuencia utilizada en el plan de barrido de desactivación de virus experimental. Posteriormente, los datos de caracterización de la amplificación de potencia se guardan en la memoria de un sistema incorporado de asistencia digital que interactúa con el generador de señales. Este sistema corrige las variaciones de frecuencia intrínsecas dentro de cada etapa de amplificación de potencia ajustando la potencia del generador de señal incidente de modo que la potencia de salida sea precisamente de 2 W (33 dBm) en todas las frecuencias.

El espectro de 0,8 a 40 GHz investigado se discretiza en 10 subbandas en función del rango de frecuencia compatible de cada designación de guía de ondas utilizada, que se resumen en la Tabla 2. El rango experimental de 0,8 a 40 GHz se seleccionó para incluir y rodear a los de 2, 3 donde se observaron resonancias para virus comparables. Se utilizaron múltiples guías de ondas para cubrir esta banda de modo que cada prueba pudiera realizarse en la frecuencia fundamental de la guía de ondas. Era crucial operar en la frecuencia fundamental de la guía de ondas para que el campo máximo estuviera en el centro de cada muestra viral. Cada subbanda utiliza un plan de barrido de microondas idéntico, que consta de 10 tonos discretos equidistantes dentro de su banda respectiva. La etapa de generación y amplificación de microondas produce cada tono con una potencia incidente de 2W a la guía de ondas durante 45 segundos, en orden ascendente, para un tiempo de barrido total de 7,5 minutos. El tiempo de barrido total se seleccionó para que fuera comparable al in2 en el que se observó una reducción viral significativa. Se preparan muestras de virus vivos de igual concentración y se dividen en grupos experimentales y de control. Ambos grupos, control y experimental, contienen cada uno tres muestras para que cada experimento (subbanda) se pueda repetir tres veces para analizar la repetibilidad y la reducción promedio de virus. Todas las muestras se almacenan en un baño de hielo durante la duración de los experimentos. Las muestras experimentales se retiran temporalmente del baño de hielo y se insertan en la guía de ondas, que luego se exponen a campos de microondas que se propagan de acuerdo con el plan de barrido descrito. Las muestras de control no reciben exposición a microondas. Para cada subbanda, el experimento se repite durante tres ensayos. El análisis de ensayo de placa se usa para determinar la reducción promedio en el virus activo de las muestras experimentales en relación con las muestras de control.

El calentamiento del medio de suero reducido (OptiMEM) se caracteriza para determinar la cantidad de calentamiento de virus durante los experimentos de desactivación de virus. Se prepara una muestra que contiene el mismo volumen del medio utilizado en los ensayos experimentales. En primer lugar, se mide la temperatura de la muestra para determinar la temperatura ambiente. A partir de entonces, la muestra se inserta en la configuración experimental donde se ejecuta el plan de barrido de desactivación de virus, exponiendo la muestra a microondas dentro de las guías de ondas. Una vez finalizado el plan de barrido, la temperatura de la muestra se mide inmediatamente para caracterizar cualquier calentamiento debido a la exposición a microondas. Este procedimiento se repite para cada subbanda incluida en este estudio para verificar que el calentamiento de la muestra sea lo suficientemente bajo y no contribuya a la desactivación del virus en todos los casos.

El método de sonda coaxial abierta se utiliza para medir la permitividad compleja del medio de suero reducido. Se utiliza un analizador de red vectorial (Anritsu MS4644B) para medir los reflejos de las puntas de las sondas. Las sondas dieléctricas se calibran utilizando medidas estándar de agua abierta, corta y desionizada. El medio de suero reducido se transfiere a un vaso de precipitados limpio de 50 mm de diámetro para preparar una muestra suficientemente grande y uniforme del líquido. Las puntas de las sondas se sumergen a una profundidad de 10 mm en el medio y se miden con el analizador de redes vectoriales. Luego se calcula la información de permitividad compleja (constante dieléctrica, tangente de pérdida) sobre la frecuencia usando las medidas de calibración. Se genera un modelo empírico a partir de las medidas de permitividad con una metodología previamente desarrollada14. Este modelo tiene en cuenta la variación de frecuencia de las propiedades EM del medio, lo que mejora significativamente la precisión de la simulación.

HCoV-229E se obtuvo de BEI Resources (NR-52726) y se propagó como se describió anteriormente19. Las reservas de HCoV-229E se titularon mediante un ensayo de formación de placas estándar en células Huh719. Las células Huh7 (JCRB0403) se obtuvieron del banco de células de la colección japonesa de investigación de recursos biológicos. Las células se cultivaron en medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) con 10 % de FBS, 50 U/mL de penicilina y 50 \(\mu\)g/mL de estreptomicina a 37 \(^\circ\)C en 5 % de CO2.

HCoV-229E se diluyó a 1 x \(10^6\) unidades formadoras de placa (PFU)/mL en OptiMEM (ThermoFisher Scientific, 31985062). Se distribuyeron alícuotas (1 ml) del virus diluido en tubos con tapón de rosca de 1,5 ml (Fisher Scientific 02-681-372) y se sometieron a los diversos tratamientos de microondas descritos. Posteriormente, la infectividad viral se evaluó mediante un ensayo de formación de placas. Células Huh7 sembradas el día anterior en placas de 12 pocillos a una densidad de 3,5 x \(10^5\) células/pozo se infectaron con muestras de HCoV-229E diluidas en serie durante 2 horas a 37 \(^\circ\)C. Después de retirar el inóculo, las monocapas celulares se cubrieron con carboximetilcelulosa al 1,2 % en DMEM que contenía FBS al 2 % y se incubaron a 33 \(^\circ\)C en CO2 al 5 % hasta 4 días después de la infección. Las células se fijaron y tiñeron con una solución de tinción de cristal violeta (1 % de cristal violeta en 17 % de metanol en H2O) para permitir la visualización de las placas. Se contaron las placas para determinar el título viral.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Este trabajo cuenta con el apoyo del Gobierno de Canadá, Departamento de Defensa Nacional, Innovación para la Excelencia y Seguridad de la Defensa (IDEaS).

Los experimentos con virus fueron apoyados por fondos del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (CCC) y una Beca de Iniciación a la Investigación de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad de Queen (CCC).

Ingeniería eléctrica e informática, Queen's University, Kingston, K7L 3N6, Canadá

Hayden Banting, Ian Goode y Carlos E. Saavedra

Ciencias Biomédicas y Moleculares, Queen's University, Kingston, K7L 3N6, Canadá

Carla E. Gallardo Flores y Che C. Colpitts

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Los autores IG, HB y CS concibieron los experimentos. Los autores IG y HB desarrollaron el hardware y los sistemas experimentales y ejecutaron los experimentos. Los autores CEF y CCC realizaron un ensayo de placa y analizaron todos los resultados experimentales. Todos los autores contribuyeron y revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Hayden Banting.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Banting, H., Goode, I., Flores, CEG et al. Espectroscopia de desactivación electromagnética del coronavirus humano 229E. Informe científico 13, 8886 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36030-6

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Recibido: 09 marzo 2023

Aceptado: 27 de mayo de 2023

Publicado: 01 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36030-6

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